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An Peter Parkers erstem Schultag an der Midtown High School erscheint der Zauberer Stephen Strange aus einem Portal und kämpft gegen ein symbiotisches Alien. Peter rettet die Schülerin Nico Minoru vor diesem Alien, wird aber bewusstlos, als ihn eine Spinne, die ebenfalls aus dem Portal kam, beißt. Einige Monate später hat Peter spinnengleiche Fähigkeiten entwickelt und ist heimlich als Superheld Spider-Man aktiv. Wegen der Zerstörung der Midtown High durch den Kampf von Strange und dem Alien besuchen Peter und Nico, die inzwischen beste Freunde sind, nun die Rockford T. Bales High School. Diese Schule bietet jedoch nicht die fortschrittlichen Kurse und die Technologie, auf die sich Peter an der Midtown gefreut hatte. Auch Peters Jugendliebe Pearl Pangan und ihr neuer Freund, der Kapitän des Footballteams Lonnie Lincoln, gehen auf die Bales. Auf dem Weg zur Schule rettet Peter einen Schüler namens Harry Osborn vor einer Gruppe von Schlägern, die ihre Tat live im Internet übertragen. Später stoppt er zwei Kriminelle, die vor der Polizei auf der Flucht sind, und erhält dadurch mehr öffentliche Aufmerksamkeit. Nach der Schule kehrt Peter in seine Wohnung zurück, die er mit seiner verwitweten Tante May Parker teilt, und wird von dem Geschäftsmann Norman Osborn begrüßt.
Norman bietet Peter ein exklusives Praktikum bei seiner Firma Oscorp an, das Peter freudig annimmt. Am nächsten Tag besucht Peter nach der Schule Oscorp und lernt dort seine Mitpraktikanten Jeanne Foucault, Asha und Amadeus Cho kennen. Er fühlt sich zunächst von dem strengen Wissenschaftler Bentley Wittman, der die Praktikanten beaufsichtigt, entmutigt. Doch seine Stimmung hebt sich, als er mit der Wissenschaftlerin Carla Connors an einem Energieprojekt arbeiten darf.
Peter verpasst den Sieg seines Schulteams beim Footballspiel und kann Nico nicht auf eine Party begleiten, zu der sie von Lonnie und Pearl eingeladen wurden. Während einer Pause in seiner Arbeit sieht Peter im Fernsehen einen Bericht über ein brennendes Gebäude. Als Spider-Man eilt er los, um zu helfen. Vor Ort trifft er auf einen Brandstifter namens Butane, der mit hochmoderner Ausrüstung angeheuert wurde, um ein Gebäude im Rahmen eines Versicherungsbetrugs niederzubrennen, jedoch versehentlich das falsche Gebäude attackiert. Peter kann Butane überwältigen und bemerkt ein stilisiertes Unendlichkeitslogo auf dessen Ausrüstung.
Zurück bei Oscorp, später als geplant, wird Peter in Normans Büro gerufen. Norman zeigt ihm Aufnahmen von Überwachungskameras, die Peter beim Anziehen seines Spider-Man-Kostüms zeigen.
Peter versucht abzustreiten, dass er Spider-Man ist, aber Norman bleibt misstrauisch. Er lädt Peter zu einem privaten Abendessen ein und erklärt, dass er nach der Rettung seines Sohnes Harry unbedingt Spider-Mans Identität herausfinden wollte. Norman richtete das Praktikumsprojekt ein, um Jeanne, Asha, Amadeus und Peter, die wahrscheinlichsten Kandidaten, die Spider-Mans Technologie entwickelt haben könnten, zusammenzubringen. Peter lehnt Normans Angebot einer Partnerschaft ab, setzt jedoch das Praktikum fort, um seiner Tante May bei der Begleichung ihrer Rechnungen zu helfen.
Als Lonnie erfährt, dass sein jüngerer Bruder Andre sich der örtlichen Gang in der 110th Street angeschlossen hat, sucht er das Hauptquartier der Gang auf, um ihn zurückzuholen. Der Anführer der Gang, bekannt als Big Donovan, zwingt Lonnie, sich der Gang anzuschließen, damit Andre gehen darf. Die Kriminellen Maria Vasquez und James Sanders erhalten von einem geheimnisvollen Gönner hochentwickelte Handschuhe und Stiefel und überfallen damit ein Juweliergeschäft. Peter kämpft gegen sie, gerät jedoch wegen deren Technologie in Bedrängnis, bis Norman ihn kontaktiert, um Unterstützung anzubieten. Nach der Niederlage der beiden bemerkt Peter, dass auf ihrer Technologie das gleiche Unendlichkeitssymbol prangt. Schließlich nimmt Peter Normans Partnerschaftsangebot an.
Die Avengers (Marvel Cinematic Universe)|Avengers sind gespalten aufgrund der Sokovia Accords, einem Gesetzesakt, der vorschreibt, dass Superhelden registriert und überwacht werden müssen. Norman ist der Meinung, dass er und Peter die Beschützer von New York City werden sollten. Daher probiert Peter verschiedene von Oscorp entworfene Superheldenanzüge an. Die Ergebnisse sind gemischt, doch schließlich entscheiden sie sich für einen Anzug, der Peters ursprünglichem Spider-Man-Design ähnelt, aber überwiegend in Weiß gehalten ist, anstelle des von Peter gewünschten rot-blauen Kostüms.
Unterdessen schickt Big Donovan widerwillig Lonnie los, um für die 110th Essen aus einem Laden zu holen, der im Gebiet einer rivalisierenden Bande, den Scorpions, liegt. Lonnie wird von einigen Scorpions bedroht. Zurückgekehrt erklärt Big Donovan, dass Lonnie und seine Familie nur dann vor den Scorpions sicher sind, wenn Lonnie der 110th treu bleibt.
Peter rettet einige Passanten vor einer Gruppe russischer Bankräuber. Als er zu Oscorp zurückkehrt, offenbart er versehentlich seine Identität vor Harry. Eine der Russinnen, Mila Masaryk, flüchtet mit dem gestohlenen Geld zu ihrem Gönner, der für verschiedene Kriminelle hochmoderne Ausrüstung herstellt: Dr. Otto Octavius (Marvel Cinematic Universe)|Otto Octavius.
Octavius verkauft Mila einen Helm, der Laser vom Stirnbereich abfeuert und die Bewegungen eines Gegners analysiert. Als ehemaliger Kollege von Norman hat Octavius sich mit seinem verdienten Vermögen aus dem Verkauf seiner Technik hohe Ziele gesteckt. Normans voller Terminkalender veranlasst ihn, auch seinen Sohn Harry in die Spider-Man-Partnerschaft einzubinden.
Unter dem Namen "Unicorn" hilft Mila ihren russischen Komplizen bei der Flucht aus dem Gefängnis. Harry beauftragt Peter, sie aufzuhalten, und es kommt zum Kampf. Mila ist kurz davor, Peter zu töten, wird jedoch von ihrem Komplizen Mikhail Sytsevich gestoppt, nachdem Peter ihm das Leben gerettet hatte. Mila hatte Mikhail als Köder im Kampf benutzt. Peter nimmt beide fest, doch Mikhail schwört Rache für seine Gefangennahme, trotz Peters heldenhafter Tat.
Später verbringt Peter Zeit mit Nico, um einen Film anzusehen, und lädt Harry ein, mitzukommen. Harrys Anwesenheit, als bekannter Gesellschaftslöwe, verärgert Nico. Währenddessen muss Lonnie das Fußballtraining verlassen, um bei einem Revierkampf der 110th gegen die Scorpions zu helfen. Nachdem er Big Donovan vor dem Anführer der Scorpions, Mac Gargan, gerettet hat, gewinnt Lonnie den Respekt der Gang und erhält von Big Donovan den Spitznamen "Tombstone".
Lonnie wird vom Fußballteam ausgeschlossen, weil er weiterhin das Training und den Schulunterricht schwänzt. Er weigert sich, Pearl zu erklären, warum er das tut. In der Zwischenzeit lädt Peter seine Freunde Harry und Nico zu sich nach Hause ein, in der Hoffnung, dass sie sich anfreunden können. Doch ihre unterschiedlichen Persönlichkeiten führen zu Spannungen.
Norman besucht ein Wohltätigkeitsdinner und erfährt dort, dass in Oscorp eingebrochen wird. Er schickt Peter, um der Sache nachzugehen. Bei seiner Untersuchung trifft Peter auf den maskierten Vigilanten Daredevil, der überzeugt ist, dass Norman etwas Unheilvolles verheimlicht. Die beiden geraten in einen Kampf, der damit endet, dass Daredevil Peter bewusstlos schlägt.
Als Peter wieder zu sich kommt, erklärt ihm Norman, dass Octavius hinter der Technologie steckt, die von Kriminellen genutzt wird. Norman vermutet, dass Octavius Daredevil beauftragt hat, bei Oscorp zu stehlen. Währenddessen rutscht Harry versehentlich heraus, dass Peter Spider-Man ist. Nico ist schockiert, als Peter zurückkommt und sie die Wahrheit bestätigt bekommt. Verärgert darüber, dass er dieses Geheimnis vor ihr verborgen hielt, verlässt sie den Raum.
Unterdessen wird Lonnie von Carmilla Black, Gargans Stellvertreterin, verfolgt. Er sucht Zuflucht im Versteck der 110ten. Carmilla spürt ihn dort auf und informiert Gargan, der von Octavius mit einer schorpionähnlichen Rüstung ausgestattet wurde.
In der Schule ignoriert Nico Peters Versuche, sich dafür zu entschuldigen, dass er ihr seine Identität als Spider-Man verschwiegen hat. Peter und Norman kommen darauf, dass Octavius Gamma-Strahlung für seine Technologie nutzt und beginnen, diese im ganzen Stadtgebiet zu verfolgen, um ihn aufzuspüren. Unterdessen führt Harry Nico zum Essen aus, um sie dazu zu bringen, Peter zu vergeben. Die beiden entwickeln eine Verbindung, nachdem er ihr das Autofahren beigebracht hat und sie sich in ein Straßenrennen mit einem ungestümen Fahrer verwickeln lassen. Obwohl Nico immer noch Schwierigkeiten hat, Peter zu vergeben, erklärt Harry ihr, dass Peter sein Geheimnis bewahrt hat, um sie zu beschützen. Nico entschuldigt sich bei Harry für ihr früheres Verhalten und nennt ihn einen Freund.
Währenddessen erfährt Pearl von Andre über Lonnies Beteiligung an der 110. Pearl stellt Lonnie in ihrem Versteck zur Rede. Als Lonnie versucht, sie wegzudrängen, wird die Gang von Gargan, der sich jetzt Scorpion nennt, angegriffen. Peter, der die Strahlung in Gargans Rüstung verfolgt, rettet Pearl und Lonnie, die mit der 110. entkommen. Norman ist beschäftigt damit, Octavius zu finden, und kann daher nur wenig im Kampf gegen Gargan helfen, was dazu führt, dass Peter schwer verletzt wird. Schließlich spürt Norman Octavius auf und schickt ein Gleiter-Gefährt, um Peter zu retten, bevor ihm etwas Schlimmeres passiert.
Peter ist nach seinem Kampf mit Gargan tief erschüttert und zweifelt an sich selbst. Norman gibt ihm ein Ultimatum: Entweder er wird zu Spider-Man oder sie beenden ihre Zusammenarbeit. Peter bricht vor seiner Tante May zusammen, und sie sehnt sich danach, dass sein Onkel Ben noch da wäre, um ihm Rat zu geben.
Norman liefert Octavius' Standort an Thaddeus Ross, den US-Außenminister, der Octavius daraufhin mit Iron Mans Hilfe verhaftet. Er hat gegen die Sokovia-Abkommen verstoßen. Am nächsten Tag besucht Peter Pearl, um bei einer schulischen Aufgabe zu helfen. Lonnie taucht bei Pearl auf und informiert sie darüber, dass die 110te Einheit Gargan verfolgt. Pearl trennt sich von Lonnie, weil er die Gang nicht verlassen will.
Aufgrund eines Tipps von Dmitri Smerdyakov, einem der Verbündeten von Mila und Mikhail, erfährt die Gang von Octavius' verlassenem Lagerhaus. Sie planen, seine Technologie zu nutzen, um gegen Gargan zu kämpfen. Da Ben fehlt, wendet sich Peter an Norman um Rat. Norman glaubt, Peter habe gegen Gargan verloren, weil er sich zurückgehalten hat, und erinnert ihn daran, dass mit großer Macht auch große Verantwortung, aber auch großer Respekt kommt.
Harry offenbart Peter, dass Oscorps Wissenschaftler einen neuen rot-blauen Spider-Man-Anzug für ihn entwickelt haben.
Norman besucht Octavius im Gefängnis, um ihn über seine Rolle bei dessen Verhaftung zu verhöhnen und offenbart, dass Octavius' Technologie an Oscorp übergeben wird. Unterdessen vereitelt Peter den Versuch der 110., die Technologie während des Transfers zu stehlen. Gargan kommt mit den Scorpions, woraufhin ein Kampf ausbricht, von dem sich Big Donovan jedoch zurückzieht. Lonnie übernimmt die Initiative und untersucht Octavius' Technologie, um etwas Nützliches zu finden. Dabei wird er einem geheimnisvollen Gas ausgesetzt, das ihm übermenschliche Stärke und Widerstandskraft verleiht. Mit seinen neuen Fähigkeiten unterstützt Lonnie Peter im Kampf gegen Gargan. Nachdem Gargan Lonnie unter Trümmern begräbt, erinnert sich Peter an Normans Rat, sich nicht zurückzuhalten. Er gerät in Rage und ist kurz davor Gargan zu töten, doch Lonnie befreit sich und hält Peter zurück. Er überzeugt ihn, nicht die Linie zu überschreiten und ein wahrer Held zu bleiben. Gargan wird verhaftet. Nico vergibt Peter, nachdem er sieht, wie dieser als Spider-Man Leben rettet. Norman drückt Peter seine Dankbarkeit dafür aus, Gargan aufgehalten zu haben. Danach trifft Norman sich mit mehreren Oscorp-Wissenschaftlern, darunter Wittman, die an geheimen Projekten arbeiten. Eines dieser Projekte versucht, Spider-Mans Kräfte nachzuahmen, indem eine Spinne mit Peters Blut injiziert wird.
Norman erklärt den Praktikanten, dass ihre Projekte dazu dienen, ein Tor ins All für das geheime Projekt Monolith zu schaffen. Strange taucht auf, um vor den Risiken zu warnen, doch Norman ordnet die Aktivierung des Tores an. Ein symbiotischer Alien kommt durch und greift an. Strange öffnet versehentlich ein Portal, das ihn und den Alien zurück in die Vergangenheit zu Peters erstem Schultag an der Midtown High versetzt. Eine der Spinnen, die Oscorp mit Peters Blut behandelt hat, entkommt durch das Portal und beißt den jüngeren Peter. Strange und der heutige Peter schicken den Alien zurück ins All und zerstören das Tor. Ein Teil des Symbionten bleibt zurück und wird von Norman entdeckt. Harry gründet seine eigene Firma, die Worldwide Engineering Brigade (W.E.B.), um junge Talente wie die Praktikanten von Oscorp zu fördern, ohne sie auszunutzen. Eingeladen sind unter anderem Amadeus, der jedoch ein Ingenieursangebot von Oscorp annimmt; Jeanne, die als Superheldin Finesse undercover im Auftrag ihres Partners Daredevil arbeitet; und Lonnie, der zum neuen Anführer des 110th wird. Später besucht May Peters inhaftierten Vater, Richard Parker.