Der Film beginnt mit einer Rückblende auf den 16. Dezember 1991, als eine geheime HYDRA-Basis in Sibirien geöffnet wird und der Winter Soldier, der dort in Kryostase ist, für eine Mission reaktiviert wird. Im Rahmen dieser Mission zwingt er ein Auto von der Straße in einen Wald und tötet die Insassen, bevor er eine Ladung Chemikalien an sich nimmt, die in dem Fahrzeug transportiert wurde.
Die Avengers reisen ein Jahr nach ihrer Mission in Sokovia nach Lagos, um den Supersoldaten Crossbones davon abzuhalten, eine Probe einer biologischen Waffe zu stehlen. Captain America nimmt ihn zwar gefangen, Crossbones aber aktiviert eine Bombe in seiner Weste.
Indem sie Crossbones mittels Telekinese bewegt, bringt Wanda Maximoff ihn aus der unmittelbaren Gefahrenzone am Boden. Die Explosion verursacht jedoch verheerende Schäden am Gebäude mit vielen Todesopfern.
Weil die öffentliche Meinung zu den Superheldinnen und Superhelden kippt, erstellen die Vereinten Nationen und der Leitung von Secretary of State General Thaddeus Ross die „Sokovia Accords”. Mit der Regelung sollen Superhelden zukünftig nicht mehr privat organisiert sein, sondern der UN Rechenschaft für ihre Taten ablegen.
Die Regelung spaltet die Avengers. Steve Rogers alias Captain America will weiterhin uneingeschränkte Handlungsfreiheit haben, während Tony Stark eine politische Kontrolle für Notwendig erachtet.
Bei der angesetzten UN-Versammlung in Wien, bei der auch der König von Wakanda T'Chaka mit seinem Sohn T'Challa anwesend ist, kommt es zu einem folgenschweren Bombenanschlag. Auf den Überwachungsvideos ist zu sehen, wie Bucky Barnes alias Winter Soldier für den Anschlag verantwortlich ist, bei dem T'Chaka getötet wurde. T'Challa, Captain America und Falcon werden nach einer Verfolgungsjagd auf Bucky Barnes von War Machine und der GSG9 festgenommen.
Helmut Zemo erscheint verkleidet als Psychologe im Joint Terrorism Task Force Hauptquartier und beginnt mit der Befragung des Winter Soldier. Mit dem Wissen um seine psychologische Programmierung aktiviert Zemo Bucky erneut. Steve Rogers und Sam Wilson können Bucky stoppen, finden aber über Bucky heraus, dass Zemo vorhat, weitere Winter Soldier zu erschaffen.
Rogers und Wilson wollen das verhindern, während Tony Stark von Thaddeus Ross den Auftrag hat, Captain America zu verhaften. Die beiden Superhelden beginnen, Gleichgesinnte um sich zu scharen.
Auf dem Flughafen in Leipzig kommt es zum grossen Show-Down: Captain America, Falcon, Wanda Maximoff, Ant-Man und Hawkeye stehen Iron Man, War Machine, T'Challa, Vision, Natasha Romanoff und Spider-Man gegenüber, die unerbittert gegeneinander kämpfen. Natasha hilft letztendlich Rogers, der mit Barnes in einem Quinjet entkommen kann. Vision versucht noch, sie mit dem Infinity-Stein in seiner Stirn aufzuhalten, trifft dabei aber War Machine, der im Anzug abstürzt und schwer verletzt wird.
Tony Stark findet heraus, dass Zemo hinter dem Anschlag auf die UN in Wien steckt und folgt den beiden zur HYDRA-Basis. Dort stellt sich heraus, dass Zemo bereits alle Winter Soldier im Kälteschlaf getötet hat und alles nur inszeniert hat, um die Avengers von innen heraus zu zerstören. Zemo offenbart aber Tony mit einer Videoaufzeichnung von 1991, dass der Winter Soldier der Attentäter war, der seine Eltern getötet hat.
Weil Tony Stark vor Wut auf Bucky losgeht, stellt sich Rogers ihm in den Weg. Der unerbitterliche Kampf zwischen den Beiden endet erst, als Tonys Anzug von Cap zerstört wird. Auch Bucky hat seinen kybernetischen Arm im Kampf verloren und Tony nimmt Cap das Schild ab, das einst Howard Stark für ihn gemacht hatte.
T'Challa kann schließlich auch Zemo davon abhalten, Selbstmord zu begehen und sich für seine Taten zu verantworten. Rogers befreit seine Freunde aus Raft Prison und schickt Tony einen Brief, in dem er alles erklärt und sich entschuldigt.
In der Mid-Credit-Szene lässt sich der Winter Soldier in Wakanda wieder in Kryostase versetzen.
In der Post-Credit-Szene muss Spider-Man seine Blessuren aus Leipzig seiner Tante May erklären.
