Als Kind entdeckt Peter Parker (Andrew Garfield), dass das Arbeitszimmer seines Vaters Richard (Campbell Scott) durchsucht wurde. Sein Vater sammelt schnell geheime Dokumente ein, bevor Peters Eltern ihn zu seiner Tante May (Sally Field) und Onkel Ben (Martin Sheen) bringen. Nachdem sie Peter in ihre Obhut gegeben haben, sterben seine Eltern bei einem Flugzeugabsturz.
Als Teenager besucht Peter die Midtown Science High School. Dort wird er von Flash Thompson (Chris Zylka) gemobbt und ist romantisch an Gwen Stacy (Emma Stone) interessiert, der Tochter von Polizeikapitän George Stacy (Denis Leary). Peter liebt Fotografie und trägt stets seine Kamera bei sich. Zuhause findet Peter die Dokumente seines Vaters und lernt, dass dieser mit Dr. Curt Connors (Rhys Ifans) bei Oscorp daran arbeitete, menschliche und tierische DNA zu kombinieren, um Krankheiten zu heilen.
Peter schleicht sich als Praktikant getarnt zu Oscorp, um Connors zu treffen. Dort trifft er auf Gwen, die leitende Praktikantin bei Connors ist, und versteckt seine Identität. Während Connors unter Druck von Dr. Ratha (Irrfan Khan) steht, ein Serum für den todkranken Oscorp-Chef Norman Osborn zu entwickeln, bricht Peter in ein Labor ein und wird von einer genetisch veränderten Spinne gebissen. Auf dem Heimweg im U-Bahn erfährt er, dass er übermenschliche Fähigkeiten entwickelt hat.
Peter findet in den Dokumenten seines Vaters den „Decay-Rate-Algorithmus” und teilt ihn mit Connors, der dies als den fehlenden Schlüssel zu seinem Serum erkennt. Connors lädt Peter ein, ihm bei der Arbeit in seinem Büro zu helfen. In der Schule kommt es zu einer Auseinandersetzung zwischen Peter und Flash, bei der Schulbesitz beschädigt wird, sodass Ben zur Schule kommen muss. Aufgrund dieses Vorfalls verpasst Ben seine Schicht bei der Arbeit und muss nachts arbeiten. Er bittet Peter, am Abend Tante May nach Hause zu begleiten. Peter ignoriert dies jedoch, um Connors bei Experimenten zu helfen.
Nach einem Streit mit Ben über dessen Missachtung kehrt Peter nicht nach Hause zurück. Bei einem Einkauf im Lebensmittelladen lässt Peter einen Dieb entkommen, der später Ben erschießt. Nach dem Fund von Bens Leiche beschließt Peter den Täter zu jagen und dabei andere Kriminelle zu bekämpfen, was ihm die Aufmerksamkeit der Polizei einbringt. Er entwickelt seinen Spider-Man-Anzug und mechanische Geräte, die Biocable-Stränge schießen.
Peter enthüllt Gwen seine Spider-Man-Identität, nachdem er bei einem Familienessen bei ihr war, und sie küssen sich. Währenddessen fordert Ratha, dass Connors das Serum sofort an Menschen testet. Connors lehnt ab und wird gefeuert. Verzweifelt testet er das Serum an sich selbst und sein fehlender Arm wächst nach. Doch sein Körper mutiert zu einem gefährlichen Lizard.
Auf der Williamsburg Bridge rettet Spider-Man mehrere Menschen, bevor Connors ins Abwassersystem flieht und wieder menschlich wird. In Connors' Büro erkennt Peter, dass Connors der Lizard ist und stellt ihn später im Abwassersystem, ohne Erfolg. Connors entdeckt Peters Identität und verfolgt ihn zur Midtown Science High School. Ein Kampf dort führt zur Fahndung der Polizei nach beiden.
Connors plant, das Serum in der Stadt zu verbreiten und alle in Lizards zu verwandeln, während Gwen im Oscorp-Labor ein Gegenmittel entwickelt. Spider-Man erreicht dank der Hilfe eines Vaters, dessen Sohn er gerettet hatte, rechtzeitig Oscorp. Er ersetzt Connors' Serum durch das Gegenmittel, das Connors wieder menschlich macht. Doch bevor Captain Stacy stirbt, zwingt er Peter, Gwen zu meiden, um sie zu schützen. Peter bricht dieses Versprechen jedoch bald.
In einer Szene nach dem Abspann wird Connors in einer dunklen Gefängniszelle von einem mysteriösen Mann gefragt, ob er Peter die Wahrheit über seinen Vater erzählt hat. Connors sagt „Nein” und fordert, Peter in Ruhe zu lassen, bevor der Mann verschwindet.
Oliver Trebes
