Peter Parker (Tobey Maguire) fühlt sich endlich sicher in seinem Leben und plant, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) einen Heiratsantrag zu machen. Mary Jane hat gerade ihr Debüt in einem Broadway-Musical gegeben. Während eines Dates stürzt ein kleiner Meteor in der Nähe ab, und ein außerirdischer Symbiote heftet sich an Peters Moped.
Zur gleichen Zeit flieht der Sträfling Flint Marko (Thomas Haden Church) vor der Polizei und gerät in einen Teilchenbeschleuniger, der seinen Körper mit dem umgebenden Sand verbindet und ihm die Fähigkeit gibt, seine Form nach Belieben zu verändern. Er wird zum Sandman. Peters bester Freund, Harry Osborn (James Franco), will Rache für den Tod seines Vaters, den er Peter zuschreibt, und greift ihn mit neuen Waffen an, die auf der Technologie des Green Goblins basieren. Während des Kampfes verletzt sich Harry am Kopf und leidet an teilweiser Amnesie, wodurch er seine Fehde mit Peter und dessen Geheimidentität als Spider-Man vergisst.
Später versucht Sandman, bei einem Festival, das Spider-Man für die Rettung von Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard) ehrt, einen Geldtransporter zu überfallen und besiegt Spider-Man. NYPD Captain George Stacy (Gwen's Vater) (James Cromwell) informiert Peter und Tante May (Rosemary Harris), dass Flint Marko der tatsächliche Mörder von Ben Parker ist und der inzwischen verstorbene Dennis Carradine (Michael Papajohn) nur ein Komplize war. Peter will Rache nehmen und wartet auf einen weiteren Schlag von Marko, während der Symbiote sich im Schlaf mit seinem Kostüm verbindet.
Als Peter aufwacht, hängt er von einem Wolkenkratzer in Manhattan und stellt fest, dass nicht nur sein Kostüm verändert ist, sondern auch seine Kräfte verstärkt wurden. Das schwarze Symbiote-Kostüm bringt die rachsüchtige, egoistische und arrogante Seite von Peters Persönlichkeit zum Vorschein. In dem neuen Anzug findet Spider-Man Marko in einem U-Bahn-Tunnel und entdeckt, dass Wasser Markos Körper auflösen kann. Er öffnet eine große Wasserleitung und verwandelt Marko in Schlamm.
Peters veränderte Persönlichkeit entfremdet Mary Jane, deren Karriere ins Stocken geraten ist. Sie findet Trost bei Harry, der sich an seinen toten Vater erinnert und Mary Jane zwingt, mit Peter Schluss zu machen. Nachdem Mary Jane Peter verlässt und behauptet, in jemand anderen verliebt zu sein, trifft Harry ihn in einem Restaurant und gibt vor, der andere Mann zu sein. Später konfrontiert Peter Harry in der Osborn-Villa.
Mit Hilfe des schwarzen Anzugs gewinnt Peter einen brutalen Kampf, der Harrys Gesicht durch eine Explosion entstellt. Vom Anzug beeinflusst, entlarvt und demütigt Peter Eddie Brock (Topher Grace), einen rivalisierenden Fotografen, der beim Daily Bugle durch gefälschte Fotos von Markos Überfällen Berühmtheit erlangt hat und Spider-Man als Verbrecher darstellt. Wütend auf die notwendige Richtigstellung, feuert J. Jonah Jameson (J. K. Simmons) Eddie. Peter ändert seinen Kleidungsstil und seine Frisur und verhält sich arrogant. Der Sandman erholt sich von seinen Verletzungen und überlebt Spider-Mans Angriff.
Um Mary Jane eifersüchtig zu machen, bringt Peter Gwen in den Nachtclub, wo Mary Jane arbeitet. Gwen erkennt den Plan und verlässt wütend den Club, während Peter Mary Jane konfrontiert. Dabei kommt es zu einer Auseinandersetzung mit den Türstehern, bei der Peter Mary Jane aus Versehen schlägt und zu Boden wirft. Peter erkennt, dass der Symbiote ihn negativ verändert und geht zum Glockenturm einer Kirche, um ihn loszuwerden. Anfangs kann er den Anzug nicht entfernen, aber die lauten Glockengeräusche schwächen den Symbioten, was Peter schließlich ermöglicht, sich zu befreien.
Eddie Brock betritt zufällig die Kirche und wird vom Symbioten besessen, was ihn zu Venom macht. Er schlägt vor, sich mit dem Sandman zu verbünden, um Spider-Man zu besiegen. Die beiden entführen Mary Jane und hängen ihr Taxi über einer Baustelle auf. Peter bittet Harry um Hilfe, wird aber zunächst abgewiesen. Nachdem Harry von seinem Butler Bernard die Wahrheit über den Tod seines Vaters erfährt, eilt er zur Rettung und bildet zusammen mit Peter ein Bündnis gegen die beiden Schurken. Im Kampf verletzt Harry den Sandman schwer, doch Venom versucht, Peter mit Harrys Gleiter zu durchbohren. Harry opfert sich und wird tödlich verletzt, was sein Schicksal mit dem seines Vaters teilt.
Während des Kampfes mit Venom erkennt Peter, dass Schallwellen den Symbioten schwächen, und schafft einen Ring aus Röhren um Venom, um einen Zaun aus Schallvibrationen zu erzeugen. Der Symbiote lässt Brock los und Peter zieht ihn mit einem Netz weg. Peter wirft eine von Harrys Kürbisbomben auf den Symbioten, doch Eddie springt in den Ring, um sich erneut mit ihm zu verbinden, und beide werden bei der Explosion getötet.
Nach dem Kampf erholt sich Flint Marko und erklärt, dass er Ben Parker nicht töten wollte, sondern dass es ein Unfall war, als Dennis seinen Arm packte und er in einem verzweifelten Versuch, das Leben seiner sterbenden Tochter zu retten, abdrückte. Ben Parkers Tod verfolgt ihn seitdem. Peter vergibt Marko, der sich auflöst und davonfliegt. Peter und Harry versöhnen sich, bevor Harry in Mary Janes und Peters Armen stirbt.
Sie besuchen Harrys Beerdigung zusammen mit Tante May, Bernard und den Stacys. Einige Tage später kommt Peter in den Jazz-Club, in dem Mary Jane singt. Sie umarmen sich, beginnen zu tanzen und ihre Beziehung zu kitten.
Oliver Trebes
